Nghiên cứu mới tiết lộ các bước hoạt động chính của phức hợp CRISPR-Cas3 ở mức cận nguyên tử

Bằng việc sử dụng kính hiển vi điện tử lạnh (cryo-electron microscopy) để chụp ảnh, các nhà nghiên cứu đã lần đầu tiên mô tả chính xác một chuỗi các sự kiện khi phức hợp CRISPR gắn vào DNA mục tiêu và cắt trình tự DNA bằng enzyme Cas3. Các cấu trúc này cũng cho thấy một quá trình với nhiều bước phát hiện lỗi sai giúp ngăn chặn sự hư hại không mong muốn của genome. CRISPR-Cas3 là một phân nhóm của phức hợp CRISPR-Cas, một công cụ sinh học phân tử đã được sử dụng rộng rãi trong việc sửa chữa gene (gene editing) một cách chính xác trong các nghiên cứu y sinh. Tuy nhiên, vấn đề về cơ chế hoạt động của nó, cụ thể như bằng cách nào nó tìm kiếm được trình tự DNA mục tiêu, vẫn chưa được hiểu rõ và những lo ngại về các ảnh hưởng không mong muốn trên các vị trí không phải DNA mục tiêu đã dấy lên những nghi ngờ về sự an toàn của phức hợp CRISPR-Cas trong điều trị bệnh ở người.

Hiểu rõ chi tiết về cấu trúc phức hợp CRISPS-Cas ở mức độ phân tử sẽ giúp làm sáng tỏ cách làm thế nào để đảm bảo tính chính xác và ngăn chặn các ảnh hưởng không mong muốn khi sử dụng CRISPR trong việc sửa chữa gene.

Maofu Liao, trợ lý giáo sư Sinh học tế bào, tại Trường Y khoa Harvard và là đồng tác giả của nghiên cứu, cho biết: “Để giải quyết các vấn đề về tính đặc hiệu, chúng ta cần phải hiểu rõ mỗi bước trong quá trình hình thành phức hợp CRISPR”. “Hiện tại nghiên cứu của chúng tôi cho thấy cơ chế chính xác về cách phức hợp CRISPR bắt đúng trình tự DNA mục tiêu, từ quá trình nhận diện bước đầu phân tử DNA mục tiêu cho đến những thay đổi cấu hình không gian khiến DNA trở nên nhạy cảm và dễ dàng bị cắt bởi Cas3”.

Tìm kiếm mục tiêu

Được phát hiện cách đây chưa đầy 1 thập kỷ, CRISPR-Cas là một cơ chế phòng vệ thích ứng mà vi khuẩn sử dụng để bảo vệ chúng khỏi virus . Quá trình này liên quan đến việc vi khuẩn sáp nhập các mảnh nhỏ DNA virus vào bộ gene của mình và tạo ra các trình tự RNA ngắn được gọi là crRNA (CRISPR RNA). Những mẫu crRNA nhỏ này được sử dụng để nhận diện sự xuất hiện của “kẻ địch”.

Hoạt động giống như một mã vạch (barcode), crRNA được xem như là thành viên của họ các enzyme CRISPR, các enzyme này thực hiện chức năng như “lính gác”, di chuyển và giám sát các mã lạ. Nếu các phức hợp riboprotein này gặp phải vật liệu di truyền phù hợp với crRNA của mình, chúng sẽ cắt nhỏ phân tử DNA đó để biến nó trở nên vô hại. Các phân nhóm của CRISPR-Cas, nhất là Cas9, có thể được lập trình với trình tự RNA tổng hợp nhân tạo để có thể cắt bộ gene tại các vị trí chính xác, cho phép các nhà nghiên cứu sửa chữa  gene một cách dễ dàng.

Để hiểu rõ hơn cách phức hợp CRISPR-Cas hoạt động, Liao đã hợp tác nghiên cứu với Ailong Ke thuộc Đại học Cornell. Nghiên cứu của họ tập trung vào CRISPR loại 1, loại phổ biến nhất ở vi khuẩn. CRISPR loại 1 sử dụng một phức hợp riboprotein được gọi là CRISPR Cascade để bắt giữ DNA và sử dụng enzyme Cas3 để cắt DNA ngoại lai.

Thông qua sự kết hợp các kỹ thuật hóa sinh và kính hiển vi điện tử lạnh, nhóm nghiên cứu đã xây dựng cấu trúc ổn định của Cascade ở các trạng thái hoạt động khác nhau, và các tấm ảnh chụp Cascade khi nó bắt giữ và cắt DNA ở độ phân giải lên đến 3,3 angstrom – xấp xỉ 3 lần đường kính một nguyên tử carbon.

Thấy mới tin

Trong phức hợp CRISPR-Cas3, crRNA được tải lên trên CRISPR Cascade, phức hợp này tìm kiếm một trình tự DNA rất ngắn được gọi là PAM, giúp nhận biết sự hiện diện của DNA virus ngoại lai.

Liao, Ke và các cộng sự đã khám phá ra rằng khi Cascade phát hiện ra PAM, nó sẽ bẻ cong phân tử DNA tại một góc nhọn, bắt buộc một phần nhỏ của phân tử DNA này tháo xoắn. Việc này cho phép một đoạn 11 nucleotide của crNRA bám với một mạch của DNA mục tiêu, hình thành một “bóng hạt” (seed bubble).

Bóng hạt hoạt động giống như một cơ cấu an toàn (fail-safe mechanism) để kiểm tra xem liệu DNA mục tiêu có bắt cặp với crRNA. Nếu chúng bắt cặp một cách chính xác, bóng hạt sẽ được mở rộng và phần còn lại của crRNA được gắn với DNA mục tiêu tương ứng của nó, hình thành nên cái gọi là cấu trúc “R-loop”.

Một khi R-loop được hình thành trọn vẹn, phức hợp CRISPR Cascade thay đổi cấu trúc không gian giúp khóa phân tử DNA vào đúng vị trí. Nó cũng tạo ra một chỗ phình ở mạch DNA thứ hai, không phải mục tiêu, chỗ phình này được xuyên qua một vị trí phân tách trên phức hợp Cascade.

Chỉ khi trạng thái R-loop đầy đủ được hình thành, enzyme Cas3 mới gắn vào và cắt phân tử DNA tại vị trí chỗ phình được tạo ra ở mạch DNA không phải mục tiêu. Nghiên cứu còn cho thấy có nhiều cơ chế phụ phức tạp nhằm đảm bảo sự chính xác và tránh việc cắt nhầm DNA của chính vi khuẩn.

Ke, đồng tác giả của nghiên cứu cho biết: “Để ứng dụng CRISPR trên người, chúng tôi phải đảm bảo hệ thống này hoạt động chính xác và nó không tác động vào các gene không phải mục tiêu”. “Chúng tôi cho rằng CRISPR-Cas3 đã tiến triển thành một hệ thống đáng tin cậy, với tiềm năng trở thành một công cụ sinh học phân tử chính xác để sử dụng cho việc sửa chữa gene. Nếu có hiện tượng nhận diện sai mục tiêu, chúng tôi sẽ biết cách điểu khiển phức hợp CRISP-Cas bởi chúng tôi nắm được các bước liên quan và nơi cần phải can thiệp”.

Bố trí hình ảnh

Các cấu trúc của CRISPR Cascade khi không có DNA mục tiêu và trong các trạng thái cấu hình không gian dạng sau R-loop (post-R-loop) đã được miêu tả, nhưng nghiên cứu này lần đầu tiên tiết lộ một chuỗi đầy đủ các sự kiện từ lúc hình thành bóng hạt cho đến khi hình thành cấu trúc R-loop ở mức độ phân giải cao.

Trái ngược với Cas9 giống như dao mổ, CRISPR-Cas3 hoạt động như một máy cắt dùng để nhai nát DNA đến mức không thể sửa lại được nữa. Cho đến nay, mặc dù CRISPR-Cas3 đã hạn chế tính thiết thực trong việc sửa chữa gene một cách chính xác, nó vẫn đang được phát triển như một công cụ để tấn công chống lại các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh. Tuy nhiên, một sự hiểu biết tốt hơn về các cơ chế hoạt động của nó có thể mở rộng phạm vi ứng dụng của CRISPR-Cas3.

Ngoài ra, tất cả các phân nhóm của CRISPR-Cas sử dụng một số dạng khác nhau trong quá trình hình thành cấu trúc R-loop để phát hiện và chuẩn bị DNA mục tiêu cho quá trình phân cắt. Việc hiểu rõ quá trình này về mặt cấu trúc có thể giúp các nhà nghiên cứu phát triển các hệ thống CRISPR-Cas để cải thiện tính chính xác của chúng và giảm khả năng xảy ra các ảnh hưởng không đúng mục tiêu trong các ứng dụng y sinh.

Min Lou, một đồng tác giả của nghiên cứu và là nghiên cứu sinh sau tiến sĩ trong phòng thí nghiệm của Liao tại trường Y khoa Harvard, cho biết: “Các nhà khoa học cho rằng những trạng thái này đều đã tồn tại nhưng vẫn chưa có bằng chứng xác thực nào cho thấy sự tồn tại của chúng”. “Những trở ngại chính chủ yếu đến từ việc xây dựng các trạng thái này trở nên ổn định về mặt sinh hóa và  mô tả cấu trúc ở mức độ phân giải cao. Bây giờ, thật sự có thể tin từ những gì chúng ta nhìn thấy”.

Luo cho biết: “Chúng tôi đã chứng minh các bước này phải xảy ra theo một trình tự chính xác”. “Về mặt tiến hóa, cơ chế này rất nghiêm ngặt và có sự phức tạp gấp 3 lần để đảm bảo rằng phức hợp này chỉ loại bỏ DNA ngoại lai”.